酶解法與表達系統制備Fab流程簡述

酶解法制備Fab

利用木瓜蛋白酶生產Fab片段

• 取實驗室自制的抗體或IgG粉末置于0.01mol/L的PBS（ph=7.4）中透析3h，調整抗體濃度1mg/mg。
• 將木瓜蛋白酶干粉溶于活化溶液（0.1mol/L PBS，ph=7.4，其中加入0.2mol/L EDTA和0.01mol/L半胱氨酸），配置成1mg/mL的溶液。37℃活化20min。
• 將木瓜蛋白酶與抗體溶液按1:10的比例混合，在37℃下反應6h。
• 將反應完產物使用10kDa的超濾管在4000rmp，4℃下超濾，除去木瓜蛋白酶，同時替換溶劑為0.01mol/L的PBS（pH=7.4），溶解后的溶液即為Fab片段與Fc片段的混合物。
• 對酶解產物進行純化。

利用胃蛋白酶生產F（ab’）₂并進一步生產Fab’片段

• 將IgG粉末100mg，溶于2 mL 0.1 mol/L pH4.0醋酸緩沖液。溶液稍成白濁，30℃，保溫10min
• 取結晶胃蛋白酶1.5 mg，溶于1.5 mL 0.1 mol/L pH4.0醋酸緩沖液，加于步驟1的溶液中，于30℃作用16h
• 用0.1 mol/L pH8.0 PBS透析一夜
• 加入硫醇，使成0.1 mol/L，在室溫下攪拌30min
• 加入1 mol/L的碘乙酰胺Iodoacetamide）使成為0.1 mol/L，室溫下攪拌1h
• 用0.01 mol/L PBS 1000L透析過夜，3000r/min，離心30min，去沉淀
• 把上清過SephadexG100 (40cm×2.0cm)以0.1 mol/L PBS洗脫
• 以每管6mL收集，約在第8管開始，Fab’片段被洗脫
• 測OD_280nm，將Fab’管合并，濃縮、凍干
• 如制備F(ab’)₂，上述4～6步驟則可以省略

Fab片段制備（大腸桿菌表達系統）

以嵌合抗CD 20抗體Fab片段在大腸桿菌中表達為例^[1](下文中提到的載體與表達菌株均由該實驗室自行構建)
表達載體構建

• 利用PCR法從抗CD₂₀ScFv表達載體上擴增V_H、V_L基因，經瓊脂糖電泳分離純化后，分別以限制性內切酶MluI+ApaI、MluI+StyI消化，然后重組到帶有人免疫球蛋白相應CH₁、C_L的pYZH1、pYZL載體相應的內切酶位點中，得到重組子pYZH1cd20、pYZH1cd20。
• 用所得的重組子轉化大腸桿菌菌株，擴增培養后提取pYZLcd20、pYZH1cd20質粒，分別以限制性內切酶MluI+NheI，SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZH1cd20。
• 瓊脂糖電泳分離純化含V_L、V_H的相應DNA片斷，利用NheI、SpeI同裂酶的特點，將這兩個片斷和經MluI+SphI消化所得的pYZF載體片斷連接成抗CD₂₀Fab表達載體pYZF1cd20。

可溶性表達及分離純化

• 將載體pYZF1cd20轉入大腸桿菌菌株，經篩選與擴大培養后，挑取陽性克隆單菌落接種5 ml含氨芐青霉素50 μg/ml的2×YT培養基（蛋白胨6%，酵母膏1%，氯化鈉0.5%，pH7.4），37℃，200 r/min，振蕩培養6 h，至OD₆₀₀＝0.6；6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌株。
• 將菌株重新懸浮于20 ml含氨芐青霉素50 μg/ml的AP₅培養基（每1 000 ml含酸水解酪蛋白11 g，酵母膏0.6 g，硫酸鎂0.19 g，葡萄糖1.5 g，氯化銨1.07 g，氯化鉀3.73 g，氯化鈉1.2 g，1 mol/L三乙醇胺(pH7.4)120 ml，過濾滅菌），30℃，250 r/min，振蕩培養20 h；6 000 r/min、4℃離心10 min收集菌體。
• 將菌體于-20℃凍存1 h，化凍后加1 ml細菌周質腔蛋白提取液，混勻，置于4℃輕搖1 h，12 000 r/min，4℃離心20 min，取上清。
• 用Protein G Agrose親和柱分離純化Fab。

蛋白質印跡實驗(Western-blot)

Fab片段制備（哺乳動物表達系統）

利用哺乳動物表達系統進行Fab片段制備的表達流程為我司內部資料。如需制備服務，請查看抗體片段制備服務頁面。

引用：[1] 賴增祖，熊冬生，范冬梅，彭輝，許元富，朱禎平，楊純正等。嵌合抗CD 20 抗體Fab片段在大腸桿菌中表達及活性鑒定[J]，中國免疫學雜志，2000,16（10）,522-523。

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