感受態,是指宿主細胞最容易接受外源基因并實現將其轉化的一種生理狀態,它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時也受菌齡以及外界環境因子的影響, 比如Ca2+就可以大大促進轉化的作用。細胞的感受態一般出現在對數生長期,新鮮幼嫩的細胞是制備感受態細胞和進行成功轉化的關鍵。
制備感受態細胞最常用的方法是用預冷的CaCl2處理對數生長期的細菌,即用低滲CaCl2溶液在低溫(0℃)時處理快速生長(進入對數生長期)的細菌,從而獲得感受態細胞。此時細胞膨脹成球形,外源DNA分子在低溫條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在細胞表面,通過熱激處理促進細胞對外源DNA分子的吸收。轉化效率非常高。此方法的關鍵在于選用的細胞必須處于對數生長期,實驗操作必須在低溫無菌環境下進行。
1、實驗儀器及試劑
LB培養基(固體、液體):Tryptone 1.00g,Yeast 0.50g,NaCl 1.00g,定容至100ml。(固體培養基加入1.5%的瓊脂)
抗性:卡那霉素,氨卞青霉素,氯霉素,四環素。
2、 實驗方法及操作步驟
隨機取1支本次制備的感受態細胞,轉化一個以前轉化成功的質粒,從轉化平板上的菌落數及表達鑒定的SDS-PAGE電泳圖(看是否出現其他的雜帶及蛋白表達情況)判斷感受態的效價。如果效價好,這批感受可以用;否則,要重新制備。
1、每次取感受態細胞時,注意查看庫存,保證庫存不低于15支,少于15支時要及時制備。
1、菌株生長在對數時進行CaCl2處理。
2、全程操作要【低溫無菌】。
3、用CaCl2溶液懸浮菌體時要均勻,不要有塊狀。
4、常用感受態細胞的選擇抗性:BL21(DE3)無抗性;BL21 Codon plus(DE3)具有氯霉素抗性;OrigamiB(DE3)具有卡那霉素抗性,不能用于具有卡那霉素抗性質粒的表達;BL21(DE3)plysS具有氯霉素抗性;Rosetta(DE3)具有氯霉素抗性;Shuffle具有鏈霉素抗性或不用抗性。