基因合成的原理與應用

人工合成基因出現在上世紀60年代，通過基因合成，可以獲得自然界中不存在的基因。目前，獲取目的基因的方法主要有三種：逆轉錄，PCR擴增，人工合成 。逆轉錄法主要適用于獲得分子量較大的未知序列的基因，它以目的基因的mRNA為模板，設計上下游引物，借助逆轉錄酶合成堿基互補的DNA鏈（即cDNA），在DNA聚合酶的作用下合成cDNA，即目的基因的雙鏈DNA。PCR主要適用于已知序列的擴增，獲得大量的目的片段，供人們肉眼觀察（RT-PCR可實現對起始模板的定量分析）。人工合成法就是采用化學合成的方法獲取目的片段，化學合成準確率較高，速度較快，同時根據不同的下游應用和密碼子的偏愛性，設計基因序列，提高表達水平。

原理

DNA合成的方法主要采用固相亞磷酰胺三酯法，運用此方法的DNA合成儀有很多，常用的有ABI 394合成儀、ABI39OO高通量合成儀，它們的區別主要在合成效率，試劑用量，耗時等方面，合成的原理是相同的，合成原理如圖：

Step 1：DMTro是5’羥基的保護基團，用TCA（三氯乙酸）和預先連接在固相載體（CPG）上的核苷酸的5’端發生反應，脫去DMT，使5’羥基端游離

Step 2：亞磷酰胺保護的dNTP和活化劑四氮唑混合，得到核苷亞磷酸活化中間體，此時3’端被活化，5’-羥基被DMTro保護

Setp 3：1、2步的產物發生縮合反應偶聯，形成新鍵C-亞磷酯鍵

Setp 4：1中會剩下部分未參與反應的5’-羥基，通過乙?；姆椒ǚ忾]5’-羥基

Setp 5：3步形成的C-亞磷酯鍵不穩定，易被水解，所以用氧化劑碘將其氧化成更穩定的磷酸三酯鍵

通過以上步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體上，將其5’端的DMTro切除，重復以上步驟合成所有需要的堿基，最后經過氨水高溫處理，將合成的鏈從固相載體CPG上切下來，根據不同的下游應用純化處理后保存。

PCR擴增簡單方便，但不能保證基因序列的完全正確性，擴增存在突變風險，且PCR對模板也具有一定的要求，因此適用性存在局限性，相對于此基因合成具有如下優勢：

優勢

1. 可以保證基因序列的完全正確性，無突變
2. 合成周期短
3. 不受模板來源限制
4. 根據不同應用，設計優化基因序列，提高表達水平

應用

人工基因合成具有極大的靈活性，根據需求自行改變設計序列

1. 進行基因優化，提高基因表達
2. 合成已知序列的難擴增基因
3. 合成大量用于微芯片的cDNA
4. 克隆人鼠抗體或重組抗體
5. 設計合成基因疫苗、基因治療載體
6. 根據基因的結構功能研究，修改設計基因
7. 合成不同的基因突變株、SNPS、或其它突變株