IPTG誘導原理（原核表達）及實驗步驟
在原核蛋白表達體系中，如E.coli（大腸桿菌表達系統），外源基因通常需要誘導劑的誘導才能進行表達，本文詳細講述了常用誘導劑IPTG誘導原理，對外源蛋白誘導表達原理以及實驗步驟。
原核生物絕大多數的基因按功能相關性成簇地排列，且密集于染色體上，共同形成一個轉錄單位——操縱子，也稱基因表達的協同單位。E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙?；D移酶（transacetylase)；此外還有調控基因：操縱序列O（operator）、啟動序列P（promoter）；而I(編碼Lac阻遏物，Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。
乳糖操縱子結構基因
IPTG誘導原理
Lac阻遏物是一種具有4個相同亞基的四級結構蛋白，都有一個與誘導劑結合的位點。在沒有乳糖存在時，lac操縱子（元）處于阻遏狀態，Lac阻遏物（即下圖中的阻遏蛋白）能與操縱基因O結合，阻礙RNA聚合酶與P序列結合，阻止了轉錄的路徑，從而抑制轉錄啟動。而當有誘導劑（這里指IPTG）存在時，誘導劑可與阻遏蛋白結合，使阻遏蛋白構象發生變化，導致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA聚合酶不再受阻礙，啟動子P開始發生轉錄，啟動反應開始發生轉錄。
在這個操縱子（元）體系中，真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞，經β-半乳糖苷酶催化，轉變為半乳糖——即生理上的誘導劑。而在實驗中，通常選用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導劑，IPTG是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩定，因此被實驗室廣泛應用。
IPTG誘導表達原理圖
IPTG誘導表達實驗方法
材料
| 試劑和培養基 | 配料 |
|---|---|
| LB（Luria—Bertani）培養基 | 酵母膏(Yeast extract) 5g 蛋白胨(Peptone) 10g NaCl 10g 瓊脂(Agar) 1-2% 蒸餾水(Distilled water) 1000ml pH 7.0 |
| IPTG 貯備液 | 2g IPTG溶于10mL蒸餾水中，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成1mL/份，-20℃保存 |
| 凝膠電泳加樣緩沖液 | 50mmol/L Tris-CL(pH6.8) 50mmol/L DTT 2%SDS（電泳級） 0.1％溴酚藍 10％甘油 |
原核表達鑒定詳細實驗步驟
- 表達鑒定第一天的任務，常用抗性選擇根據感受態細胞選擇
- 拿到質粒，離心（3000r/min；2min)
- 在質粒中加入TE【使質粒最終加入到110μL感受態細胞中的量為80-100ng，據此確定加入TE的量】，一般為(1μg質粒加20μLTE；2μg質粒加50μLTE；5μg質粒加100μL?TE)
- 將質粒與TE混勻，吸取2μL混液與感受態細胞混勻
- 將感受態細胞放入冰箱（4℃）中，30min
- 取出后立即放入水浴鍋中（42℃），熱激90s,
- 再次放入冰箱（4℃）中，3min
- 拿出后取200μL的LB液體培養基加入到已轉入質粒的感受態細胞中
- 放入搖床（37℃;??195r)?中,??30nim至60min;?(最佳45min)
- 取出離心（3000r/min；2min)
- 去掉200μL的上清，留100μL左右上清懸浮沉淀，吸取50μL懸液涂平板，【先將對應抗性的平板放入培養箱（37℃）中預熱20min】
- 把平板放入培養箱（37℃），過夜（12h至16h）
2. ?表達鑒定第二天的任務，注意Pcold表達載體的表達溫度
- 每個平板挑取單菌落至4支對應抗性的LB(4ml)試管中，編號為“0”“1”“2”“3”
- 將試管放入搖床（37℃；195r)?中，【單抗3h左右；雙抗4h左右；剛開始用可見分光光度計測OD值；熟練后可目測（背光下，以試管中的槍頭為例，剛剛看不見槍頭即可）】，測OD值（0.6至0.8）
- 從“0”號管中取700μL懸液加入到100μL（C=80%）的保種甘油中，震勻，放入冰箱（-20℃）凍存
- 在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入2μL的IPTG【終濃度0.5mM最適，可根據日后表達摸索】
- 視不同的載體選擇適合的表達環境【PET/PGEX：15℃表達過夜；25℃表達6h；37℃表達3h至4h（4支試管，“0”“1”號試管15℃表達過夜；“2”“3”試管37℃表達3h至4h）。Pcold：【全部15℃表達過夜】
3. 表達鑒定第三天，全菌的表達鑒定分析，注意控制溶質的量及溶液黏度
- 從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中，【若OD值不一樣，值小的可多取】離心（6000r/min)，5min,?去上清，留沉淀【沉淀少的，可再取菌液離心，盡量使沉淀量接近】
- 在每個離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀，離心（6000r/min)，5min,?去上清，留沉淀
- 在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading?Buffer懸浮沉淀【當溶質適量且均一的情況下，加入量不變；當溶質多且粘稠時，應使加入量增大，為降低粘度也可減少上液量】
- 放入煮樣器（100℃）?25min
- 取出后離心（6000r/min)??3min, ?電泳檢測。
- 蛋白表達量不錯，進行蛋白純化；蛋白表達量低或者沒表達，可參考原核表達FAQ相對應解決方案解決。
4. 蛋白純化：見蛋白純化專題