本文根據自身實驗經驗總結,針對PCR實驗過程出現的問題舉例,提供可實施的解決方法。并根據經驗列舉了提高PCR反應特異性的方法。
現象:正對照有條帶,樣品無條帶
可能原因:
解決方法:
現象:空白對照出現條帶
可能原因:
解決方法:
現象:電泳出現拖尾、涂抹帶
可能原因:
解決方法:
一般小于100bp的條帶可基本判斷為引物二聚體
主要原因:
解決方法:
引物最好在模板cDNA的保守區設計,長度15-30bp,GC含量小于60%,3’端不超過連續三個G或C,堿基分布錯落有致,避免引物自身形成二聚體,設計完成之后,需進行BLAST檢測,如果與其他基因不具有互補性,則可以進行下一步實驗。
降落PCR是一種簡單的降低非特異性產物的PCR,最大的優點就是可以降低實驗耗時,同時又可以優化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度,退火溫度過高會使PCR效率過低,過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優化,但費時費力。降落PCR提供了一個較為簡易的優化方法。首先在較高的溫度下擴增,此時雖然擴增效率低,但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低,非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產物已經達到一定的數量優勢,因此會對非特異擴增產生強烈的競爭抑制,從而大幅提高PCR的特異性和效率。
采用熱啟動方法進行擴增,是除了設計最佳引物之外,提高PCR反應特異性最好的方式。在一般的PCR反應中,試劑的配置需在冰上進行,且要將PCR儀預熱,這種方法就類似于熱啟動,能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性,只要體系中有DNA鏈存在,就會擴增產生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前完全抑制酶的活性,而最有效的方法就是使用熱啟動酶或高保真酶去擴增,它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心,當溫度上升到95℃時恢復活性,指導擴增。
采用巢式PCR進行擴增,在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通PCR不同的是,它采用兩對引物進行擴增,首先用第一對引物普通PCR,然后將第一輪擴增的產物稀釋100倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴增。因此采用巢式PCR可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。
瓊脂糖凝膠濃度 | DNA分離范圍 |
---|---|
0.3% | 5000-60000 |
0.5% | 1000-30000 |
0.7% | 800-12000 |
1.0% | 500-10000 |
1.2% | 400-7000 |
1.5% | 200-3000 |
2.0% | 50-2000 |