PCR問題及提高PCR擴增特異性的方法總結

相關技術：PCR標準操作流程

本文根據自身實驗經驗總結，針對PCR實驗過程出現的問題舉例，提供可實施的解決方法。并根據經驗列舉了提高PCR反應特異性的方法。

PCR常見問題分析

問題1：假陰性（無擴增產物）

現象：正對照有條帶，樣品無條帶

可能原因：

• 模板：含有Taq酶抑制劑、雜蛋白，模板上樣量低或模板降解
• 引物：引物降解，引物設計不合理
• 試劑：酶失活，buffer不合適
• 反應條件：退火溫度高，延伸時間短

解決方法：

• 純化模板并重新提取，并檢測模板是否含有抑制劑
• 重新設計引物并低溫保存
• 優化buffer，摸索鎂離子濃度或適當加入DMSO（小于0.3%）
• 提高退火溫度，增加延伸時間（反應條件參照試劑盒說明書）

問題2：假陽性

現象：空白對照出現條帶

可能原因：

• 引物設計不適，與目的序列具有同源性
• 試劑污染：水、移液槍等被核酸污染
• 樣品間出現交叉污染

解決方法：

• 實驗儀器高壓滅菌
• 實驗試劑（酶除外）高壓滅菌，離心管槍頭一次性使用
• 規范實驗操作
• 假陽性可通過巢式PCR解決，或者使用特異性較高的試劑盒擴增

問題3：拖尾、彌散

現象：電泳出現拖尾、涂抹帶

可能原因：

• 酶用量過多
• 模板純度較低
• dNTP、鎂離子濃度過高
• 循環次數過多

解決方法：

• 減少用酶量或使用特異性高的熱啟動酶擴增
• 純化模板
• 減少dNTP用量，摸索鎂離子濃度
• 減少循環次數

問題4：二聚體及非特異性產物

一般小于100bp的條帶可基本判斷為引物二聚體

主要原因：

• 引物設計不合理，引物自身具有互補性
• 引物濃度不適
• 鎂離子濃度過高，退火溫度過低

解決方法：

• 重新設計引物并進行BLAST檢測
• 降低鎂離子濃度，提高退火溫度
• 增加模板用量

提高PCR反應特異性的方法

1. 引物的設計

引物最好在模板cDNA的保守區設計，長度15-30bp，GC含量小于60%，3’端不超過連續三個G或C，堿基分布錯落有致，避免引物自身形成二聚體，設計完成之后，需進行BLAST檢測，如果與其他基因不具有互補性，則可以進行下一步實驗。

2. 降落PCR

降落PCR是一種簡單的降低非特異性產物的PCR，最大的優點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度，退火溫度過高會使PCR效率過低，過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優化，但費時費力。降落PCR提供了一個較為簡易的優化方法。首先在較高的溫度下擴增，此時雖然擴增效率低，但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產物已經達到一定的數量優勢，因此會對非特異擴增產生強烈的競爭抑制，從而大幅提高PCR的特異性和效率。

3. 熱啟動擴增

采用熱啟動方法進行擴增，是除了設計最佳引物之外，提高PCR反應特異性最好的方式。在一般的PCR反應中，試劑的配置需在冰上進行，且要將PCR儀預熱，這種方法就類似于熱啟動，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有DNA鏈存在，就會擴增產生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前完全抑制酶的活性，而最有效的方法就是使用熱啟動酶或高保真酶去擴增，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心，當溫度上升到95℃時恢復活性，指導擴增。

4. 巢式PCR

采用巢式PCR進行擴增，在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通PCR不同的是，它采用兩對引物進行擴增，首先用第一對引物普通PCR，然后將第一輪擴增的產物稀釋100倍后用第二對引物（巢式引物）二次擴增。因此采用巢式PCR可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。

5. 合適的瓊脂糖凝膠的濃度

瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍