蛋白質的分離純化之不同材料的預處理方法

常用的蛋白純化技術介紹

摘要：本文介紹了在蛋白表達純化試驗中，對不同來源的材料的預處理。主要從植物，動物和微生物三種源材料的特點和注意事項進行描述，并附有原核蛋白表達的案例。

蛋白質在分子生物學中的分類，大體上可分為天然蛋白和重組蛋白。提取天然蛋白和構建重組蛋白都需要先確定生物原材料，如植物材料主要以植物的葉，胚，果實和根莖等為主；動物通常是選用實驗動物的器官和組織；而微生物則是微生物菌體本身或發酵液。從原則上講，任何一種自然界中存在或不存在的蛋白質都可以被外源表達出來，像原核蛋白表達就是以大腸桿菌（E.coli）為宿主菌表達克隆基因，在原核表達體系中，重組蛋白的含量比雜蛋白的含量高的多，所以選擇和設計合適的分離純化方案對于重組蛋白表達純化的下游實驗就顯得尤為重要。

在提取和分離蛋白時有以下幾點需要注意：

1. 蛋白質提取應盡量多的提取出活性蛋白，避免各因素導致目的蛋白失活；
2. 選用不同的溶劑提取分離蛋白質（大多數蛋白溶于水，稀鹽，稀酸等，少數與脂類結合的蛋白則溶于乙醇等有機溶劑）；
3. 提取蛋白一般在低溫環境中操作，避免蛋白質在提取過程中降解（可加入蛋白酶抑制劑，如PMSF、EDTA、antipain 和 leupeptin等）；
4. 提取時緩沖液的用量通常是原材料的1~5倍，提取時注意均勻攪拌，這樣有利于蛋白的溶解（緩沖液通常選用PH≈7,0.15mol/L磷酸鹽緩沖液或PH7.5,0.1mol/L Tris-Hcl緩沖液）；
5. 蛋白質提取常用各種水溶液，一般是在偏離等電點0.5pH以上，此時蛋白的溶解度增加；
6. 用稀酸提取等電點在堿性范圍內的蛋白質，用稀堿提取等電點在酸性范圍內的蛋白，盡可能提高目的蛋白在提取液中的溶解度。

不同材料的處理

1. 植物材料的預處理

植物體內通常存在著為數眾多的天然蛋白，提取時通常選用一些器官為主要原料。但植物提取蛋白時存在一些特殊問題，導致蛋白質的得率較動物和微生物的要低。

因為植物材料中除目的蛋白外還含有大量的淀粉，纖維素和果膠等雜志，所以初步的均質化處理需要在大量緩沖液中進行，初步過濾后得到低濃度蛋白，之后需要進行硫酸銨沉淀和PEG沉淀進行分離，分離后的蛋白可與其他蛋白一樣，采用一般的蛋白純化處理。

2. 動物材料的預處理

動物原材料組織中含有豐富的目的蛋白，根據蛋白質所處的不同位置（胞內，胞外，亞細胞器等），應選用不同的組織破碎方式。對于少量組織，可使用小型均質器，大量組織則采用搗碎機快速搗碎方法。對于軟組織，可使用玻璃均質器。組織均質化后，將不同亞細胞結構內的蛋白酶釋放到溶液中，使之與目的蛋白接觸并降解，最后進行純化處理。

注意：均質化時間盡可能短，減少不必要的蛋白質水解變性
      在4℃預冷的緩沖液中進行均質化處理和后期分離操作，有助于降低蛋白質水解
      在緩沖液中添加蛋白酶抑制劑控制蛋白質水解

3. 微生物材料的預處理

微生物可產生多種天然蛋白和重組蛋白，提取天然蛋白，首先要對大量菌株篩選獲得高產菌株，再進行誘變育種分離產量更高的正突變菌株，最后通過基因工程技術提高內源微生物蛋白產量。而重組蛋白的提取相對來說就簡單地多，微生物可以通過發酵的方式，短時間內大量培養，從而分離出大量可純化的目的蛋白。與植物和動物處理方法相比較，微生物蛋白通常比來源于植物和動物的相同蛋白質要更加穩定，也更易于遺傳學操作。只要篩選出正確的培養條件，就可以獲得大量的特定蛋白質菌體。

4. 細菌的裂解

細胞的破碎裂解是指用物理、化學、酶或機械等方法破壞細胞壁或細胞膜，從而將胞內物質（目的蛋白）釋放到周圍環境的過程。針對不同用途和類型的細胞壁發展了多種方法，目前常用方法大體上可分為機械法和非機械法倆類，常用的機械破碎法有：高溫珠磨法；高壓勻漿；超聲破碎法。而非機械法包括滲透壓沖擊法；凍融破碎法；酶溶法；化學破碎法等。下面介紹在實驗室研究中應用較為廣泛的酶溶法和超聲破碎法。

酶溶法

常用的溶解酶有溶菌酶；β-1,3 -葡聚糖酶；β-1,6 -葡聚糖酶；蛋白酶；殼多糖酶；糖昔酶等。溶菌酶主要作用于細菌類，而其他幾種酶對酵母作用較為顯著。

主要步驟為：

1. 4 ℃，5000rpm 離心15 min，收集誘導表達的細菌培養液（100 mL）。棄上清，每克濕菌內加3 mL
   裂解緩沖液，懸浮沉淀；
2. 沉淀稱量，每克菌內加8mL PMSF及80mL溶菌酶，攪拌20 min；邊攪拌邊每克菌加4 mg脫氧膽酸
   （低溫中進行）；
3. 37 ℃，玻棒攪拌，至溶液粘稠時每克菌內加20mL DNase I。室溫放置至溶液不再粘稠。

超聲破碎法

聲頻為 15-20 kHz 的超聲波在高強度聲能輸入下可以對細胞進行破碎，在處理少量樣品時具有操作簡便，重復性好，節省時間，液體量損失較少等優勢，同時還可對染色體DNA進行剪切，降低液體的粘稠度。

主要步驟為：

1. 收集 1 L 誘導表達的工程菌，40 ℃ ，5000r pm 離心，15 min ；棄上清，每克濕菌加 3 mLTE 緩
   沖液；
2. 按超聲處理儀廠家提供的功能參數進行破菌；10000g離心，15min，分別收集上清液和沉淀；
3. 分別取少量上清和沉淀，加入凝膠電泳加樣緩沖液，進行SDS -PAGE檢測。

注意：超聲破碎與聲頻、聲能、處理時間、細胞濃度、菌種類型等因素有關，應根據具體情況掌握；超聲波破菌前，標本經 3 -4 次凍溶后更容易破碎。

案例——從大腸桿菌中提取誘導表達的His₆-X

簡介

大腸桿菌表達系統操作簡便，能夠獲得優化的表達質粒。而組氨酸標簽（His）6是常用的重組蛋白純化
標簽。

材料

感受態細胞、表達載體、LB培養基、氨芐青霉素、IPTG、蛋白酶抑制劑、Ni-NTA親和層析柱、超聲波
破碎儀、高速冷凍離心機、紫外分光光度計、結合緩沖液（50mmol/L Tris，PH7.9，500mmol/L NaCl，5mmol/L 咪唑）、洗脫緩沖液（50mmol/L Tris，PH7.9，500mmol/L NaCl，500mmol/L 咪唑）

方法

1. 采用RT-PCR擴增得到目的基因X，構建到表達載體上；
2. 用構建質粒表達轉化菌株，LB平板37℃培養過夜；
3. LB平板上挑取一單菌接入5mL LB培養基（100ug/mL Amp），37℃培養3~5h；
4. 將5mL菌液接入1L LB液體培養基中（100ug/mL Amp），37℃培養至OD60≈0.6，加入0.3mmol/L的IPTG，16℃誘導16h；
5. 將培養好的菌液放入離心機中，5000r/min離心10min，棄去上清，收集菌體，離心后的菌體沉淀懸浮于25mL結合緩沖液中；
6. 將懸浮菌液裝在50mL玻璃燒杯中，加入適量蛋白抑制劑（10uL的10mg/mL antipain），冰浴放置；
7. 超聲破碎，每個循環26次，超聲6s，間隔5s，根據破碎效果共2~4個循環，破碎后的菌體4℃ 18000r/min 離心30min，上清液保持在4℃；
8. Ni柱先用結合緩沖液平衡，然后上樣，結合30min后，每5~10min攪拌一次，靜置流干；
9. 用2~3倍柱體積結合緩沖液清洗非特異性結合蛋白，再加入15mL洗脫緩沖液洗脫，可分倆次加入以增加洗脫效率；
10. SDS-PAGE檢測初步純化效果，進行下一步純化步驟。

問題分析及解決方案

1. 目的蛋白得不到可溶性表達或表達量很低
   原核蛋白表達過程中，選擇構建合適的表達載體需要考慮三個因素：表達載體、表達菌株、表達誘導條件。針對這三個方面對表達實驗進行調整，優化表達條件；考慮更換不同的表達菌株（BL21、Rosetta、Origami PLysS等）；表達載體可換成帶有其他有助于可溶性蛋白表達的標簽載體（GST，MBP）。
2. 表達出來的蛋白易降解
   首先要保證原核蛋白表達的操作過程處于低溫環境；操作過程中適當的補加一些蛋白酶抑制劑，盡量縮短提取時間；洗脫的目的蛋白溶液于4℃短暫保存，不易時間過長；注意超聲波的處理條件，判斷是否由超聲波處理過于劇烈而造成的降解。

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