哺乳動物細胞重組抗體表達
單抗和多抗定義
蛋白結構表面可以使免疫系統產生抗體的區域叫抗原決定簇（又稱抗原表位見右圖）。它一般由6-12個氨基酸或碳水基團組成，可以是由連續序列組成或不連續的蛋白質三級結構組成。一個抗原可以有許多不同的抗原決定簇，因此，機體可以產生多種不同的抗體。由單一B淋巴細胞產生僅識別一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。由多種B細胞產生，受到多種抗原決定簇刺激并可與多種抗原表位結合的抗體稱為多克隆抗體。單抗與多抗的區別可參考單抗與多抗的區別。重組抗體生產根據基因序列制備得到單抗，通過構建穩定表達細胞系滿足對抗體量的生產。
重組抗體和免疫抗體制備
抗體的生產有兩種方式。①利用重組蛋白的方式獲取接近天然條件下的重組蛋白（或多肽），通過刺激動物免疫系統，最終獲得抗體。②利用哺乳動物細胞生產，在已知抗體基因序列的前提下，將基因序列克隆到相應載體上，進行重組抗體的表達。刺激動物免疫系統可以生產單抗或多抗，這種方法成功率高且抗體效價較好。而通過序列進行重組抗體表達，針對特定基因只能生產單抗。兩種生產方式在作用原理和流程等方面都有一定的區別和聯系，具體如下：
1.生產流程
哺乳動物細胞重組抗體生產
刺激動物免疫系統制備單抗
兩種方式制備單抗綜述
- 抗原的制備：通過刺激動物免疫系統生產單抗前提是要獲得抗原，抗原可以是可溶性蛋白，多肽?？扇苄缘鞍淄ㄟ^重組蛋白生產得到。多肽作為抗原與載體偶聯免疫小鼠，用多肽進行篩選，如不能進行抗體篩選，需偶聯另一種載體進行篩選；
- 免疫動物：免疫動物一般選用6周齡的小鼠，根據自己制定的實驗方案操作。用已經制備的抗原免疫小鼠，使其分泌B淋巴細胞，進行下一步的融合；
- 細胞融合：實驗前準備好骨髓瘤細胞，骨髓瘤細胞與B淋巴細胞按照一定的比例融合，形成雜交瘤細胞；
- 雜交瘤細胞選擇培養篩選：用HAT篩選①培養基篩選融合成功的雜交瘤細胞；
- 融合細胞的單克隆生長鑒定：采用有限稀釋法或其他方法進行雜交瘤細胞的克隆培養，通過鑒定最終得到能夠生產單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞。
哺乳動物重組抗體在以上流程的基礎上進行
- 構建穩定表達細胞系：對上述實驗得到的抗體測序得到抗體的序列，利用哺乳動物細胞生產重組抗體的方式表達，篩選可穩定表達的細胞系。
- 單克隆抗體的大量制備：篩選出能夠穩定生產的細胞系，滿足后續對抗體的大量需求，節約后續實驗時間。
2.制備單抗的原理
哺乳動物細胞重組抗體表達
傳統的生產抗體的方式是用抗原刺激動物免疫系統，這種方式需先制備抗原，且利用這種方法生產抗體難以滿足大量的生產（需求大量的實驗耗材和時間）。而哺乳動物細胞生產抗體的方式有一定的優勢。①已知抗體的基因序列，將序列克隆到表達載體上，導入到哺乳動物細胞體內培養，通過一系列的篩選簡單最終獲得能夠穩定生產此抗體基因的穩定細胞系，這一過程需要大量的時間，才能篩選出足夠穩定表達的細胞系，并能夠在后續實驗中穩定長期生產。②未知序列的抗體大量生產，先刺激動物免疫系統得到少量抗體通過測序得到抗體序列，通過哺乳動物細胞重組抗體表達篩選穩定表達的細胞系，滿足大量生產需求。
刺激動物免疫系統制備抗體
制備抗原，用抗原刺激動物免疫系統，將抗原處理過的B細胞和骨髓瘤細胞融合，融合后的細胞既具有B細胞合成專一抗體的特性同時又能夠無限增殖（B淋巴細胞不能再體外生長，應用雜交瘤技術可使其在體外無限增殖）。經過HAT篩選，體外培養融合成功的細胞或在體內腹水培養，單克隆生長，最終進行抗體檢測。刺激動物免疫系統生產抗體需要制備抗原，抗原可通過重組蛋白生產的方式獲得，通過先獲得抗原再生產抗體。
HAT培養基篩選雜交瘤細胞的原理
細胞融合是一個隨機的過程，融合后可能會出現的細胞有雜交瘤細胞，融合的脾細胞與脾細胞，融合的瘤細胞與瘤細胞，未融合的脾細胞，未融合的瘤細胞以及細胞多聚體。那么，如何才能篩選出雜交瘤細胞？對于正常的脾細胞，它在培養基中的存活期為7-14天，因此無需特別篩選，細胞的多聚體也容易死去，只有未融合的瘤細胞需要特別篩選除去。
選擇培養基有三種關鍵成分：次黃嘌呤（hypoxanthine，H），氨基喋呤（aminopterin，A），胸腺嘧啶脫氧核苷（thymidine，T），故稱為HAT培養基。
細胞DNA合成有兩個途徑：
A.主要途徑：由糖，磷酸，氨基酸，CO2，NH3等化合物合成核苷酸，進而合成DNA，葉酸作為重要的輔酶參與這一合成過程。而氨基喋呤是是葉酸的拮抗物，可以阻斷雜交瘤和瘤細胞通過這一途徑合成核苷酸。
B.應急途徑：在次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷共同存在的情況下，經過次黃嘌呤鳥嘌呤轉磷酸核糖轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）共同催化合成DNA。而瘤細胞是該兩種酶的缺陷型，因此不能再HAT培養基上生長，不合成或不分泌免疫球蛋白，只有融合的雜交瘤細胞具有脾細胞和瘤細胞的遺傳性能，可以通過應急途徑合成DNA，在HAT培養基上長期存活，繁殖和分泌抗體。