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測序信號衰減或中斷是測序過程中的常見問題,原因多種多樣:模板中含有重復序列,或是模板含有高級結構所致,模板中GC含量過高等都有可能使測序信號衰減,此外,引物的質量,試劑失活也有可能造成此現象。解決方法:采用反向引物測序,通過序列拼接獲得全長,過程中可適當的加入DMSO,并使用高級試劑盒擴增。
測序中間出現重疊峰(雙峰),是因為序列前面有連續的堿基出現,或是測序引物堿基缺失。如果一直出現重疊峰,就是序列本身有非特異性條帶,非特異性條帶的話就要從PCR擴增開始分析,注意提高PCR擴增的特異性,擴增可以選擇高特異性的Taq酶(如熱啟動酶),能夠大大的降低錯配,提高擴增序列的特異性。也可以做TA克隆,采用單克隆測序。測序的引物,最好自己提供,保證引物的特異性并防止降解(不要選擇通用引物),同時表明測序結果提供序列全長。
Poly(A/T/C/G)結構的測序易出現移碼現象并導致測序信號衰減中斷,這是因為序列中有連續的堿基出現所致,建議采用反向引物測序獲得全長。
目的片段插入失?。ㄌ峁┑目寺殛栃钥寺。┗蚺囵B過程中目的片段丟失,只要重新挑取單克隆,進行PCR后送去測序即可。
測序引物要求較高,理論上可以用PCR擴增時的引物測序,但不能測得全長,當測序完成時,可以從中間設計引物反向測一個,這樣便能得到序列全長。測序的引物3’端要和模板完全配對,長度16-22bp左右,GC含量50%左右,測序引物純度有很高要求,必須經過純化且純度至少大于90%。