測序樣品分析與問題解決

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測序樣品分析

1. 測序的樣品可以有PCR產物，菌（新鮮菌液、穿刺菌、平板菌、甘油菌），質粒。測序提供的樣品最基本的原則就是要保證樣品的量和純度。
2. PCR產物測序，PCR產物測序的第一要素是PCR產物的純度，如果是PCR產物原液，則需要經過瓊脂糖凝膠電泳純化后再進行測序，如果不經過電泳產物回收純化這一步，測序容易出現亂峰或疊峰，如果是已經純化好的PCR產物，可直接測序。第二要素是引物，引物必須經過純化，純度至少大于90%。
3. 菌液測序，需提供足量的新鮮的菌液，新鮮菌液成功率較高，測序公司可以直接提取質粒測序。
4. 菌體可以是多種形式平板菌、穿刺菌。兩者都是在含有抗生素的固體培養基中，可用肉眼觀察到菌落并保證無雜菌污染。
5. 質粒測序要提供一定濃度和量，注明名稱，酶切位點及片段大小。此外，小于100bp片段一般是先克隆再測序，直接測序較難得到結果。

測序問題與解決

1. 測序信號衰減/中斷



測序信號衰減或中斷是測序過程中的常見問題，原因多種多樣：模板中含有重復序列，或是模板含有高級結構所致，模板中GC含量過高等都有可能使測序信號衰減，此外，引物的質量，試劑失活也有可能造成此現象。解決方法：采用反向引物測序，通過序列拼接獲得全長，過程中可適當的加入DMSO，并使用高級試劑盒擴增。

2. 測序出現重疊峰/亂峰



測序中間出現重疊峰（雙峰），是因為序列前面有連續的堿基出現，或是測序引物堿基缺失。如果一直出現重疊峰，就是序列本身有非特異性條帶，非特異性條帶的話就要從PCR擴增開始分析，注意提高PCR擴增的特異性，擴增可以選擇高特異性的Taq酶（如熱啟動酶），能夠大大的降低錯配，提高擴增序列的特異性。也可以做TA克隆，采用單克隆測序。測序的引物，最好自己提供，保證引物的特異性并防止降解（不要選擇通用引物），同時表明測序結果提供序列全長。

3. poly結構測序結果亂峰/衰減/中斷

Poly（A/T/C/G）結構的測序易出現移碼現象并導致測序信號衰減中斷，這是因為序列中有連續的堿基出現所致，建議采用反向引物測序獲得全長。

4. 測序結果為空載體

目的片段插入失?。ㄌ峁┑目寺殛栃钥寺。┗蚺囵B過程中目的片段丟失，只要重新挑取單克隆，進行PCR后送去測序即可。

5. 測序引物

測序引物要求較高，理論上可以用PCR擴增時的引物測序，但不能測得全長，當測序完成時，可以從中間設計引物反向測一個，這樣便能得到序列全長。測序的引物3’端要和模板完全配對，長度16-22bp左右，GC含量50%左右，測序引物純度有很高要求，必須經過純化且純度至少大于90%。